A técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) tornou-se parte do vocabulário cotidiano nos tempos de Covid-19. Exames exigidos para viagens internacionais e diagnóstico mais preciso têm utilizado esse tipo de técnica, mas como ela funciona?
O PCR consiste em multiplicar um trecho específico do DNA milhares de vezes sem a utilização de organismos vivos. Uma espécie de reprodução genética laboratorial. Com isso, em uma questão de horas, é possível desenvolver material genético do paciente em volume suficiente ára detectar e analisar a presença dos indicadores e traços que o ensaio visa procurar.
O PCR vem sendo há tempos utilizado por laboratórios clínicos e de biogenética com o objetivo de identificar doenças de cunho hereditário, detectar traços de organismos patógenos, realizar testes de paternidade e DNA e outros ensaios.
Através do PCR, é possível amplificar a amostragem genética de qualquer coleta, seja sangue, urina, tecidos e fragmentos. A técnica não se restringe a humanos – pode e é também usada em análises de animais de qualquer espécie, vegetais, fungos e micro-organismos, inclusive fossilizados.
A reação
A reação química utilizada no teste de PCR baseia-se na função natural de uma enzima termoestável – a Taq DNA Polimerase, ou simplesmente “Taq”. Essa enzima é extraída da bactéria Thermus aquaticus, uma extremófila encontrada em fontes hidrotermais oceânicas, localizadas em profundidades abissais.
A escolha da bactéria tem a ver com o próprio processo utilizado. A enzima é processada num aparelho termociclador, que esfria e aquece o material, fazendo com que a enzima da bactéria extremófila seja a mais adequada para suportar o procedimento.
Como é feita a técnica PCR passo a passo
O processo ocorre em três etapas, que em conjunto compõem um ciclo que é realizado por um número determinado de vezes:
- desnaturação das cadeias de DNA: em torno de 92 °C, as duas cadeias de DNA são separadas, ou desnaturadas.
- hibridização ou anelamento dos primers: em temperatura próxima de 55 °C, ocorre o emparelhamento dos iniciadores a um local específico da cadeia de DNA.
- extensão: ao redor dos 72°C, a Taq DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA complementar. Posteriormente, reinicia-se um novo ciclo, que dá origem a novos filamentos e assim sucessivamente.
A desnaturação separa a molécula de DNA em dois filamentos de nucleotídeos e, a seguir, ocorre o anelamento dos primers (iniciadores). Os primers são pequenas fitas de DNA complementares. Elas se conectam ao início da sequência de DNA que se deseja reproduzir. Como na desnaturação são formadas dois filamentos-molde por molécula de DNA, são necessários dois primers distintos para o sucesso do procedimento.
Após a desnaturação e pareamento, a enzima (representada pela parte verde no esquema acima) adiciona desoxirribonucleotídeos complementarmente aos filamentos de molde, compondo novas moléculas de DNA.
A quantidade de DNA final segue uma função exponencial. Após completado o procedimento, a concentração de DNA-molde na solução torna-se muito maior, o que permite a sua identificação. Os resultados no PCR são conseguidos, após o procedimento, por meio da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.
Há dois tipos de análises PCR distintas – a qualitativa e a quantitativa. realiza a medição da amplificação por meio da eletroforese em gel. Já o teste quantitativo (qPCR), ou “em tempo-real”, possibilita a medição das moléculas amplificadas ao final de cada ciclo de termociclagem através da avaliação da fluorescência.
Por: Carlos Artur Matos
